對乳制品中進行內酰胺酶檢測的方法分享

　　乳中抗生素的來源主要有兩種途徑,一是采用β-內酰胺類抗生素治療牛乳腺炎造成牛乳中抗生素殘留，二是奶牛長期喂飼含抗生素的飼料,很容易造成乳中抗生素殘留川。飲用含有抗生素的牛奶可能導致飲用者對抗生素的過敏反應,或因長期接觸抗生素而導致耐藥。泌乳奶牛經過藥品合理間隔期后擠奶，可以減少抗生素在奶中殘留,實現無抗奶。因此,世界各國都嚴格限定原料乳抗生素最大殘留*'2。β-內酰胺酶是由對β-內酰胺類抗生素耐藥菌株分泌的一種胞外酶。該酶可選擇性分解β-內酰胺類抗生素，能夠使青霉素內酰胺結構破壞而失去活性。由于利益驅動使得不法分子利用β-內酰胺酶降解乳中所含抗生素。該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素，導致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力。
 

　　對乳制品中進行內酰胺酶檢測的方法：
 

　　1.范圍
 

　　本標準規定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類藥物的檢驗方法。
 

　　本標準適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質的檢驗。
 

　　本方法的檢出限為4U/mL。
 

　　2.原理
 

　　該方法采用對青霉素類藥物絕對敏感的標準菌株，利用舒巴坦特異性抑制β-內酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對照，通過比對加入β-內酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產生的抑制圈的大小來間接測定樣品是否含有β-內酰胺酶類藥物。
 

　　3.操作步驟
 

　　3.1 菌懸液的制備
 

　　將藤黃微球菌接種于營養瓊脂斜面上，經36士1℃培養18h-24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測定菌懸液濃度，終濃度應大于1×1010 CFU/mL，4 ℃保存，貯存期限2周。
 

　　3.2 樣品的制備
 

　　將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標為：A、B、C、D，每個樣品做三個平行，共12 管，同時每次檢驗應取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對照。如樣品為乳粉，則將乳粉按1:10的比例稀釋。如樣品為酸性乳制品，應調節pH值至6-7。
 

　　3.3 檢驗用平板的制備
 

　　取90mm滅菌玻璃培養皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測用培養基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108 CFU/mL藤黃微球菌的抗生素檢測用培養基Ⅱ,凝固后備用。
 

　　3.4 樣品的測定
 

　　按照下列順序分別將青霉素標準溶液、β-內酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到樣品及純水中：
 

　　A 青霉素5 μL。
 

　　B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
 

　　C β-內酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。
 

　　D β-內酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
 

　　混勻后，將上述A～D 試樣各200 μL 加入放置于檢驗用平板上的4個無菌牛津杯中，36士1℃培養培養18～22 h ，測量抑菌圈直徑。每個樣品，取三次平行試驗平均值。
 

　　3.5 結果報告
 

　　純水樣品結果應為：(A)、(B)、(D)均應產生抑菌圈；(A)的抑菌圈與(B)的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(含3 mm)，且重復性良好；(C)的抑菌圈小于(D)的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復性良好。如為此結果，則系統成立，可對樣品結果進行如下判定：
 

　　6.1 如果樣品結果中(B)和、(D)均產生抑菌圈，且(C)與(D)抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm)時，可按7.1.1、7.1.2 判定結果。
 

　　6.1.1(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復性良好，應判定該試樣添加有β- 內酰胺酶，報告β- 內酰胺酶類藥物檢驗結果陽性。
 

　　6.1.2(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差異小于3 mm，且重復性良好，應判定該試樣未添加有β- 內酰胺酶，報告β- 內酰胺酶類藥物檢驗結果陰性。
 

　　6.2 如果(A)和(B)均不產生抑菌圈，應將樣品稀釋后再進行檢測。