對乳制品中進(jìn)行內(nèi)酰胺酶檢測的方法分享

　　乳中抗生素的來源主要有兩種途徑,一是采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療牛乳腺炎造成牛乳中抗生素殘留，二是奶牛長期喂飼含抗生素的飼料,很容易造成乳中抗生素殘留川。飲用含有抗生素的牛奶可能導(dǎo)致飲用者對抗生素的過敏反應(yīng),或因長期接觸抗生素而導(dǎo)致耐藥。泌乳奶牛經(jīng)過藥品合理間隔期后擠奶，可以減少抗生素在奶中殘留,實(shí)現(xiàn)無抗奶。因此,世界各國都嚴(yán)格限定原料乳抗生素最大殘留*'2。β-內(nèi)酰胺酶是由對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌株分泌的一種胞外酶。該酶可選擇性分解β-內(nèi)酰胺類抗生素，能夠使青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)破壞而失去活性。由于利益驅(qū)動使得不法分子利用β-內(nèi)酰胺酶降解乳中所含抗生素。該酶的使用掩蓋了牛奶中實(shí)際含有的抗生素，導(dǎo)致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力。
 

　　對乳制品中進(jìn)行內(nèi)酰胺酶檢測的方法：
 

　　1.范圍
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物的檢驗(yàn)方法。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類物質(zhì)的檢驗(yàn)。
 

　　本方法的檢出限為4U/mL。
 

　　2.原理
 

　　該方法采用對青霉素類藥物絕對敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對照，通過比對加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產(chǎn)生的抑制圈的大小來間接測定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。
 

　　3.操作步驟
 

　　3.1 菌懸液的制備
 

　　將藤黃微球菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，經(jīng)36士1℃培養(yǎng)18h-24 h，用生理鹽水洗下菌苔即為菌懸液，測定菌懸液濃度，終濃度應(yīng)大于1×1010 CFU/mL，4 ℃保存，貯存期限2周。
 

　　3.2 樣品的制備
 

　　將待檢樣品充分混勻，取1 mL待檢樣品于1.5 mL離心管中共4管，分別標(biāo)為：A、B、C、D，每個樣品做三個平行，共12 管，同時每次檢驗(yàn)應(yīng)取純水1 mL加入到1.5 mL離心管中作為對照。如樣品為乳粉，則將乳粉按1:10的比例稀釋。如樣品為酸性乳制品，應(yīng)調(diào)節(jié)pH值至6-7。
 

　　3.3 檢驗(yàn)用平板的制備
 

　　取90mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿，底層加10 mL滅菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后上層加入5 mL含有濃度為1×108 CFU/mL藤黃微球菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ,凝固后備用。
 

　　3.4 樣品的測定
 

　　按照下列順序分別將青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品及純水中：
 

　　A 青霉素5 μL。
 

　　B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
 

　　C β-內(nèi)酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。
 

　　D β-內(nèi)酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。
 

　　混勻后，將上述A～D 試樣各200 μL 加入放置于檢驗(yàn)用平板上的4個無菌牛津杯中，36士1℃培養(yǎng)培養(yǎng)18～22 h ，測量抑菌圈直徑。每個樣品，取三次平行試驗(yàn)平均值。
 

　　3.5 結(jié)果報告
 

　　純水樣品結(jié)果應(yīng)為：(A)、(B)、(D)均應(yīng)產(chǎn)生抑菌圈；(A)的抑菌圈與(B)的抑菌圈相比，差異在3 mm以內(nèi)(含3 mm)，且重復(fù)性良好；(C)的抑菌圈小于(D)的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3 mm)，且重復(fù)性良好。如為此結(jié)果，則系統(tǒng)成立，可對樣品結(jié)果進(jìn)行如下判定：
 

　　6.1 如果樣品結(jié)果中(B)和、(D)均產(chǎn)生抑菌圈，且(C)與(D)抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm)時，可按7.1.1、7.1.2 判定結(jié)果。
 

　　6.1.1(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差異在3 mm以上(含3 mm),且重復(fù)性良好，應(yīng)判定該試樣添加有β- 內(nèi)酰胺酶，報告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陽性。
 

　　6.1.2(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差異小于3 mm，且重復(fù)性良好，應(yīng)判定該試樣未添加有β- 內(nèi)酰胺酶，報告β- 內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)結(jié)果陰性。
 

　　6.2 如果(A)和(B)均不產(chǎn)生抑菌圈，應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行檢測。